Analisi mutazionale completa del gene CFTR

Questo progetto è sviluppato in collaborazione tra il Centro di Riferimento Regionale per la Fibrosi Cistica del Lazio, Istituto di Clinica Pediatrica, e la Sezione di Biochimica Clinica, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia; entrambe sono strutture dell’Università degli Studi di Roma “La Sapienza”. L’Associazione Laziale Fibrosi Cistica ha sostenuto con borse di studio parte del personale impegnato nel progetto. Ogni struttura ha impiegato propri fondi di ricerca per il finanziamento del progetto. La parte di ricerca riguardante le forme atipiche è stata recentemente finanziata anche mediante fondi di ricerca ottenuti congiuntamente dai 2 gruppi come finanziamento di un “Progetto di Ateneo” e di un “Progetto della Fondazione per la Ricerca sulla Fibrosi Cistica”. Lo scopo generale del progetto è quello di mettere in opera test genetici di II livello per la ricerca delle mutazioni del CFTR e di caratterizzare completamente (mediante il ritrovamento di 2 mutazioni) i pazienti afferenti al Centro di Riferimento FC. Ciò è fondamentale dal punto di vista diagnostico: il ritrovamento di 2 mutazioni su 2 alleli diversi consente la piena definizione della diagnosi, con la risoluzione di eventuali diagnosi dubbie. E’ inoltre importante dal punto di vista prognostico: la completa individuazione delle mutazioni nei pazienti affetti e la correlazione con l’aspetto clinico, consente il miglioramento della definizione del rapporto tra genotipo e fenotipo potendo permettere (attualmente in maniera limitata ma in futuro in un numero sempre maggiore di casi) la previsione del decorso della malattia. Sarà inoltre, speriamo in un immediato futuro, importante anche nella terapia. Poter infatti prevedere, dal genotipo, quale sarà l’evoluzione clinica della malattia può consentire la pianificazione e calibrazione degli interventi terapeutici, al limite personalizzati. Ad esempio è attualmente operativo un programma di farmacogenomica per lo screening di una gran quantità di sostanze specifiche per classi mutazionali del CFTR (in alcuni casi addirittura per mutazioni individuali specifiche). Inoltre anche lo studio di strategie di terapia genica si sta indirizzando più sull’inserimento di piccoli frammenti di DNA limitati alla zona della mutazione piuttosto che all’inserimento di tutto il gene. E’ evidente che per poter accedere, in futuro, a questi trattamenti è indispensabile la conoscenza di entrambe le mutazioni del paziente.

Individuazione, ottimizzazione e validazione dei metodi per la ricerca di mutazione del CFTR

Il test di I livello che viene effettuato, indipendentemente da questo progetto, per la caratterizzazione genetica iniziale dei pazienti consiste nella ricerca delle 31 mutazioni più comuni del CFTR (mediante un test denominato PCR/OLA/SCS), di cui 17 rappresentate nell’Italia Centrale. Sebbene poco più della metà dei pazienti siano completamente caratterizzati dal punto di vista genetico mediante questo test iniziale, tutti gli altri necessitano di test genetici a più alta sensibilità diagnostica (test di II livello), che siano in grado cioè di indagare la quasi totalità delle mutazioni del CFTR. Inizialmente, quale test di II livello, è stato deciso di mettere a punto il sequenziamento completo della regione codificante, delle zone introniche (non codificanti) adiacenti gli esoni e della zona iniziale, anch’essa non codificante ma di regolazione (5’-flanking) del gene. Successivamente questo approccio è stato integrato mediante un saggio, sempre originalmente messo a punto nell’ambito di questa ricerca, di indagine rapida (SNaPshot) di 20 mutazioni del CFTR (aggiuntive alle 31), di cui 14 rappresentate nell’Italia Centrale (selezionate mediante la precedente fase di sequenziamento). Sequenziamento completo. Per la messa a punto e validazione del sequenziamento completo, sono stati progettati, fatti sintetizzare e verificati dal punto di vista della funzionalità gli oligonucleotidi necessari all’amplificazione e successivo sequenziamento delle zone menzionate del gene CFTR. Si tratta di circa 120 oligonucleotidi, costituenti le coppie “esterne” (per l’amplificazione) e “interne” (per il sequenziamento dell’amplificato). Sono stati messi in uso 2 analizzatori genetici multicapillari ABI PRISM 3100 Avant a 4 capillari che si sono rivelati estremamente sensibili e rapidi nella produzione delle sequenze. E’ stato inoltre personalizzato e messo in opera il programma SeqScape dedicato al confronto di sequenze sperimentalmente ottenute tra loro e con quelle “wild type” di riferimento; questo software è particolarmente indicato per l’analisi semiautomatica di un gran numero di sequenze. E’ stato inoltre utilizzato un sito web specifico per il CFTR per la caratterizzazione delle variazioni di sequenza ottenute. I risultati ottenuti mediante questo metodo di sequenziamento completo del CFTR, dopo la fase di ottimizzazione e messa in opera, possono dirsi completamente soddisfacenti. Questo grazie anche al disegno sperimentale che permette il trattamento di 96 campioni contemporaneamente in tutte le fasi sperimentali e di analisi: amplificazione in PCR, purificazione degli amplificati, controllo elettroforetico, cycle sequencing, purificazione delle sequenze, esecuzione delle corse elettroforetiche capillari, analisi software. Questa fase di ottimizzazione del metodo ha consentito di individuare procedure operative standard e protocolli sperimentali comuni per tutti gli operatori che si occupano della caratterizzazione genetica. SNaPshot. Per aumentare la produttività nella ricerca di quel gruppo di mutazioni del CFTR che significativamente elevano la sensibilità diagnostica (preliminarmente individuate mediante il sequenziamento completo) è stato ottimizzato un metodo di analisi rapido, basato su tecnologia SnaPshot. Anche in questo caso la funzionalità del test è ottima e l’architettura generale del saggio permette il trattamento simultaneo di molti campioni. Formazione del personale. Il personale, operante sia presso il Centro FC che la Sezione di Biochimica Clinica, è stato formato all’utilizzo delle specifiche tecniche di genetica molecolare che vengono impiegate per lo studio in corso del gene CFTR, nonché all’utilizzo dei necessari metodi e software di analisi. Questo consentirà di applicare le tecniche messe a punto grazie a questo progetto anche alle caratterizzazioni genetiche future. L’IDENTIFICAZIONE DI 3 NUOVE MUTAZIONI DEL CFTR. Nel corso del progetto, analizzando pazienti affetti non completamente caratterizzati dal punto di vista genetico, sono state individuate 3 mutazioni del CFTR mai descritte in precedenza. Quando viene trovata una nuova variazione di sequenza nel DNA di un certo gene, occorre dimostrare che tale variazione possa (o meno) originare la malattia in studio, sia cioè una mutazione causa di malattia e non semplicemente un polimorfismo (normale variabilità interindividuale). Questo, contrariamente a quanto si può pensare, non è un compito semplice. Ad esempio non è sufficiente dimostrare che la variazione di sequenza cambia l’aminoacido, in quanto questo cambiamento potrebbe non essere così grave da far insorgere la malattia. In genere si procede cercando di dimostrare che: 1) la frequenza della variazione di sequenza trovata è estremamente bassa in una popolazione di non affetti (normalmente assente analizzando circa 100 soggetti della popolazione generale); 2) il cambiamento di sequenza provoca un cambiamento di aminoacido in una regione critica della proteina; 3) nel soggetto affetto in cui è stata trovata la variazione di sequenza non è presente nessun’altra mutazione sullo stesso allele (ma è presente un’altra mutazione sull’altro allele). Per alcune mutazioni (ad esempio quelle di splicing) sono praticabili, in maniera relativamente semplice, anche studi funzionali a livello di RNA messaggero. La nuova mutazione G1244R. E’ questa una mutazione, situata nell’esone 20, che provoca la sostituzione dell’aminoacido glicina, normalmente presente nella proteina CFTR, con l’arginina; questo cambiamento è una modifica strutturale rilevante che avviene in una zona cruciale della proteina (il secondo dominio di legame dell’ATP). Questa mutazione è risultata assente in 116 soggetti della popolazione generale. Il soggetto affetto non aveva nessun’altra mutazione sullo stesso allele. La mutazione è risultata inoltre assente in un gruppo di soggetti con ipertripsinemia alla nascita e in un gruppo di pazienti affetti da FC; ciò suggerisce che la mutazione è probabilmente rara (forse esclusiva della famiglia in cui è stata trovata). Altre 2 mutazioni sono già state descritte in letteratura a carico della tripletta che codifica per la glicina 1244, caratterizzandola come una zona ad elevato tasso di mutazione. La nuova mutazione G1247R(G->C). Anche questa mutazione è situata nell’esone 20. Provoca un cambiamento della glicina in posizione 1247 (3 aminoacidi più a valle dell’altra) ad arginina. La modifica strutturale è la stessa della mutazione precedente con conseguenze sullo stesso critico dominio proteico. Anche in questo caso la mutazione risulta assente nella popolazione generale (74 soggetti) ed è l’unica presente sull’allele del paziente analizzato. La stessa sostituzione aminoacidica (glicina ad arginina in posizione 1247) era già stata descritta in letteratura sebbene originata da una diversa sostituzione nucleotidica (3871G->A) rispetto a quella da noi trovata (3871G->C). Anche questi autori descrivono la G1247R(G->A) come una mutazione causa di malattia. Anche questo caso quindi conferma che la zona di DNA che codifica per il secondo dominio di legame dell’ATP è soggetta ad un elevato tasso di mutazione. La nuova mutazione 3849+29del10(AGACTGTGTT). E’ questa una variazione di sequenza situata nell’introne 19. Poiché intronica non ha conseguenze dirette sulla proteina. Tuttavia potrebbe modificare la proteina indirettamente, mediante un’alterata maturazione dell’RNA messaggero originando fenomeni di “splicing” anomalo. Che questo possa essere l’effetto è estremamente probabile, data l’estensione strutturale della delezione (10 nucleotidi), proprio in prossimità della giunzione esone/introne. Rimane comunque un’ipotesi da convalidare sperimentalmente. A questo scopo gli studi di frequenza sono già in corso e abbiamo pianificato studi funzionali per la valutazione dell’RNA messaggero.

Analisi mutazionale del CTFR dei pazienti affetti.

L’approccio a 3 step. La procedura standard di ricerca mutazionale individuata, ed attualmente applicata, grazie al presente progetto è: ricerca a pannello mediante PCR/OLA/SCS di 31 mutazioni (di cui 17 rappresentate) -> ricerca a pannello mediante SNaPshot di 20 mutazioni (di cui 14 rappresentate) -> sequenziamento completo. Il primo step costituisce il test di I livello; gli altri 2 step il test di II livello. La ricerca delle 31 mutazioni e il test SNaPshot sono relativamente rapidi e poco costosi. Il sequenziamento completo, più costoso e laborioso delle 2 tecniche precedenti, si rende necessario solo per un numero ristretto di pazienti (quelli con genetica ancora incompleta dopo le precedenti caratterizzazioni). Sebbene il 3° step di sequenziamento completo non sia ancora stato applicato a tutti quei pazienti che pure ne avrebbero bisogno, i risultati ottenuti lasciano prevedere che la sensibilità complessiva di questo approccio sia molto alta, probabilmente superiore al 95% degli alleli e al 90% dei genotipi. Infatti, finora, tutti i pazienti sottoposti a questa analisi sono stati completamente caratterizzati con 2 mutazioni sui 2 alleli diversi. Mutazioni individuate. Sono state individuate 23 differenti mutazioni del CFTR, aggiuntive rispetto a quelle inserite nel pannello di I livello e ciascuna causa di malattia, di cui 3 da noi descritte per la prima volta. Tra queste 23 mutazioni, 14 raggruppate in 7 esoni sono state inserite nel saggio SnaPshot: D110H, R117C, H139R (esone 4), G1244R (esone 20, nuova), G1244E (esone 20), A349V, R334L, T338I (esone 7), L997F (esone 17a), R1066C, L1077P, L1065P (esone 17b), S549R(A->C) (esone 11), Y849X (esone 14a). Le altre mutazioni individuate ma, per il momento, non inserite in un saggio rapido sono: 711+3A->G (esone 5), L320V, M348K (esone 7), D836Y (esone 14a), P1013L (esone 17a), G1069R (esone 17b), D1152H (esone 18), 3849+29del10(AGACTGTGTT) (introne 19, nuova), G1247R(G->C) (esone 20, nuova). Caratterizzazioni genetiche effettuate. Nel data base degli affetti FC afferenti al Centro di Riferimento risultano 402 pazienti totali. Tra questi, 321 risultano essere già stati analizzati (indipendentemente da questo progetto) mediante il test di I livello mentre 81 pazienti non risultano ancora analizzati mediante questo test (di cui 25 persi al follow-up e 56 in parte già richiamati per la caratterizzazione di I livello). Il test alle 31 mutazioni ha mostrato una sensibilità allelica del 77.4% (497 alleli caratterizzati su 642 analizzati) e una sensibilità genotipica del 62.6% (201 pazienti caratterizzati con 2 mutazioni su 321 analizzati). I pazienti in cui si riesce ad evidenziare 1 sola mutazione (mut/unknown) mediante il test di I livello rappresentano il 30.2% (97 su 321) e quelli con entrambe le mutazioni non individuate sono il 7.2% (23 su 321). All’inizio della caratterizzazione genetica estesa i pazienti che necessitavano del test genetico di II livello erano, quindi, 120; di questi tuttavia 10 sono stati persi al follow-up: 110 pazienti erano potenzialmente analizzabili con in totale (tra genotipi mut/unknown e unknown/unknown) 129 alleli non caratterizzati dal test di I livello. Ad oggi, di questi 110 pazienti analizzabili ne sono stati studiati 76 (34 sono ancora da analizzare), inizialmente mediante il pannello di mutazioni relativo al test SNaPshot. Questo test ha mostrato un incremento della sensibilità allelica, rispetto al test di I livello, dell’8.7% (34 alleli caratterizzati su 88 non caratterizzati alle 31 mutazioni) e un incremento della sensibilità genotipica del 12.8% (26 pazienti a cui è stato completato il genotipo su 76 originariamente incompleti dopo test alle 31 mutazioni). I 50 pazienti analizzati mediante il pannello SNaPshot ma nonostante ciò non ancora completamente caratterizzati, sono stati ulteriormente studiati applicando il protocollo di sequenziamento completo. Sebbene il CFTR non sia ancora stato sequenziato interamente in tutti questi pazienti, si è ottenuto un ulteriore incremento della sensibilità allelica del 6.4% (25 alleli ulteriormente caratterizzati su 54 sfuggiti sia al test alle 31 mutazioni che al test SNaPshot) e genotipico dell’11.3% (23 pazienti il cui genotipo è stato completato su 50 incompleti ai 2 test precedenti). Quindi, la sensibilità allelica cumulativa risulta: 31 mutazioni -> 77.4% +SNaPshot -> 86.1% +sequenziamento completo (sebbene ancora non ultimato per alcuni pazienti) -> 92.5%. La sensibilità genotipica cumulativa risulta: 31 mutazioni -> 62.6% +SNaPshot -> 75.4% +sequenziamento completo (sebbene ancora non ultimato per alcuni pazienti) -> 86.7%. In pratica dei 76 pazienti sottoposti ad approfondimento, 49 sono stati completamente caratterizzati grazie al test SnaPshot ed al successivo protocollo di sequenziamento; 27 necessitano invece del completamento del protocollo di sequenziamento. Mediante questo approccio in meno del 2% dei pazienti affetti non riusciamo a trovare neanche una mutazione (contro oltre il 7% del test di I livello), considerando anche che il 3° step non è ancora stato applicato completamente. In pratica ad un qualsiasi soggetto che si sottopone a questa metodologia, e a cui non troviamo nessuna mutazione, possiamo dare l’informazione di non essere affetto, con una probabilità di sbagliare inferiore al 2%. Ciò costituisce un ausilio diagnostico molto potente.

Analisi mutazionale nei soggetti con forme atipiche, con diagnosi di FC incerta o di casi particolari.

Nel corso del progetto è emerso il problema della diagnosi nelle forme atipiche di FC. Molti di questi soggetti presentano infatti una diagnosi incerta, il che pone anche problemi terapeutici e prognostici. Per affrontare questo argomento sono stati analizzati alcuni soggetti di popolazioni con forme atipiche di FC (ad esempio soggetti con infertilità maschile, neonati con ipertripsinemia alla nascita, soggetti oligosintomatici) per ricercare mutazioni e/o tratti varianti specifici che possano in qualche modo costituire la base molecolare della loro eventuale patologia. I pazienti di questo tipo che sono stati studiati in totale nell’ambito del gruppo di ricerca sono oltre 200, di cui tuttavia solo 37 nell’ambito di questo progetto di ricerca. Ci siamo concentrati soprattutto sulle variazioni introniche o esoniche silenti (senza cambio aminoacidico), che possono causare forme atipiche di FC producendo un alterato processamento dell’RNA. Nel complesso abbiamo evidenziato 35 variazioni di sequenza (di cui 8 nell’ambito di questo progetto di ricerca) tra cui alcune mai precedentemente descritte, potenzialmente coinvolte nella definizione di queste forme atipiche. Tutte queste variazioni andranno caratterizzate mediante confronto della loro frequenza tra la popolazione generale e le popolazioni sospette. Per le variazioni la cui frequenza dovesse risultare significativamente più elevata nelle popolazioni sospette che nella popolazione generale, andrà effettuata la caratterizzazione funzionale mediante studi di espressione del CFTR. Per alcune di queste variazioni tali caratterizzazioni sono già iniziate. Alcune di queste variazioni di sequenza erano già descritte come tratti varianti (quindi causa di malattia). Ciò ha permesso di definire la diagnosi (sia in senso positivo che di esclusione della malattia) in 32 dei 37 soggetti con diagnosi originariamente incerta studiati in questo progetto. Neonati eterozigoti per 1 mutazione del CFTR, positivi allo screening neonatale, con test del sudore “borderline”. In questi soggetti la diagnosi si è rivelata particolarmente difficile: il sospetto di malattia origina dalla concomitante presenza di 1 mutazione al test di I livello, di alti livelli di tripsina immunoreattiva dosata in corso di screening neonatale e dal valore incerto del test del sudore. D’altra parte sono assenti chiari segni clinici della malattia. Il problema consiste nel fatto che la mancata effettuazione della diagnosi può significativamente peggiorare le condizioni di vita future. Solo l’analisi genetica estesa può individuare la seconda mutazione o escluderla (con un minimo margine di errore) e quindi risolvere (in un senso o nell’altro) la diagnosi di questi casi particolari. Alcuni soggetti di questo tipo sono stati analizzati durante il presente progetto con la conclusione che, almeno una parte di essi, sono in effetti malati FC. E’ tuttavia necessario precisare che, ogni anno, vengono selezionati dallo screening neonatale circa 20 soggetti con queste caratteristiche che necessitano di un’approfondita indagine genetica. Analisi mutazionale di famiglie particolarmente complesse. Durante l’esecuzione del progetto ci si è imbattuti in casi estremamente particolari per i quali sono state necessarie indagini molto più complesse che nei casi usuali. Vengono di seguito descritti 2 esempi. Famiglia N. 1. L’indagine delle 31 mutazioni ha evidenziato, in un soggetto definito non malato, dall’assenza di uno dei picchi wild-type. La successiva analisi di sequenza ha permesso l’individuazione di 2 mutazioni all’interno dello stesso esone (E627del/2184insA) probabilmente interferenti con il metodo usato per l’analisi delle 31 mutazioni. In questo caso deve essere studiata la segregazione allelica; poiché i genitori del soggetto non sono disponibili per il prelievo e sfruttando il fatto che le 2 mutazioni si trovano a distanza ravvicinata, verrà effettuato il clonaggio del frammento di interesse in un vettore plasmidico e il sequenziamento dei singoli cloni. Ciò consentirà l’assegnazione allelica delle 2 mutazioni. Qualora la segregazione allelica fosse confermata (cosa estremamente probabile) ci troveremmo di fronte ad un genotipo raro, che provoca un risultato anomalo in una comune tecnica di ricerca di mutazioni, con fenotipo praticamente normale. Famiglia N. 2. La nuova mutazione G1247R(G->C) è stata individuata in una famiglia in cui l’analisi delle 31 mutazioni caratterizzava il padre come genotipicamente normale, la madre apparentemente omozigote per la mutazione W1282X, una delle figlie eterozigote per la W1282X e l’altra figlia apparentemente omozigote per la W1282X. Entrambe queste mutazioni, G1247R(G->C) e W1282X si trovano nell’esone 20. Al sequenziamento si è evidenziato che la figlia apparentemente omozigote per la W1282X era in realtà eterozigote composta W1282X/G1247R(G->C); quest’ultima mutazione probabilmente interferisce con le sonde utilizzate nel metodo a 31 mutazioni producendo il risultato anomalo. Il padre risultava eterozigote per la G1247R(G->C) (mutazione non compresa nel pannello delle 31). La madre, apparentemente omozigote per la W1282X risultava invece eterozigote per questa mutazione ma anche eterozigote per il polimorfismo 4002 A/G che, evidentemente, interferisce anch’esso con il test delle 31 mutazioni.