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LA RICERCA DELLE MUTAZIONI DEL CFTR

L'Associazione Laziale Fibrosi Cistica ha recentemente finanziato 2 annualità di borsa di studio (dal 1 luglio 2005 al 30 giugno 2006 e dal 1 maggio 2007 al 30 aprile 2008) a favore della Dott.ssa Silvia Pierandrei (inserita in un ampio contesto di attività di ricerca), per lo svolgimento di 2 successivi progetti tra loro collegati, in collaborazione tra il Centro di Riferimento della Regione Lazio per la Fibrosi Cistica e la Sezione di Biochimica Clinica del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, entrambe della Sapienza Università di Roma. L'argomento del progetto di ricerca del primo anno era la completa caratterizzazione genetica di tutti i pazienti affetti da Fibrosi Cistica (FC) afferenti al Centro di Riferimento, mediante la definizione dell'adatta metodologia di ricerca mutazionale; l'ulteriore sviluppo nel secondo anno è stata la caratterizzazione funzionale delle variazioni nella sequenza del DNA trovate (la comprensione, cioè, dell'effetto sulla salute della persona nella quale è stata individuata la specifica variazione nella sequenza) e l'individuazione di alleli complessi (con più di una mutazione sullo stesso allele) quali fonti di variabilità genetica nella FC.
Il filo conduttore di questi studi è quello di mettere in opera sofisticati test genetici per la ricerca di tutte le mutazioni del CFTR (il gene responsabile della FC) in modo da caratterizzare completamente (mediante il ritrovamento di 2 o, a volte, anche più mutazioni) i pazienti FC, mettendo poi in relazione il risultato genetico con l'effetto patologico di queste mutazioni (una tematica che è nota come rapporto genotipo - fenotipo). Questi studi, già complessi anche solo relativamente alle forme tipiche di FC, diventano ancora più difficili per l'esistenza di forme atipiche, oligosintomatiche (note come CFTRpatie) originate da mutazioni a volte molto rare e diverse da quelle classiche. La completa comprensione di queste tematiche è fondamentale dal punto di vista diagnostico: il ritrovamento di (almeno) 2 mutazioni su 2 alleli diversi consente la piena definizione della diagnosi, con la risoluzione di eventuali diagnosi dubbie. E' inoltre importante dal punto di vista prognostico: la definizione della correlazione tra le mutazioni trovate e l'aspetto clinico, permette (attualmente in maniera limitata ma in futuro in un numero sempre maggiore di casi) la previsione del decorso della malattia. Inoltre, la piena conoscenza del genotipo e delle conseguenze cliniche, sta diventando cruciale anche nelle sempre più vicine applicazioni delle terapie personalizzate (in base al tipo di mutazioni presenti nei pazienti).
In una prima fase di progetto, sono stati individuati, ottimizzati e validati i metodi per la ricerca di mutazioni del CFTR che vengono attualmente utilizzati. Il test genetico inizia con la ricerca delle 32 mutazioni più comuni del CFTR (mediante un test denominato PCR/OLA/SCS), di cui 17 rappresentate nell'Italia Centrale; mediante questo test si riescono ad individuare, nei pazienti FC di questa area geografica, circa il 78% degli alleli mutati. Si prosegue poi con un saggio originalmente messo a punto nell'ambito della ricerca (che abbiamo chiamato CF-SNAP+20), che consiste nell'indagine di 20 mutazioni del CFTR (aggiuntive alle 32), di cui 14 rappresentate nell'Italia Centrale (selezionate mediante una precedente fase di sequenziamento); mediante l'applicazione di questo test, la frazione di alleli mutati individuati sale a circa l'88% . Infine, se ancora il paziente non risulta completamente caratterizzato dal punto di vista genetico, si applica il protocollo di sequenziamento esteso del CFTR, anch'esso originalmente messo a punto nell'ambito della ricerche svolte, con l'individuazione del 96% degli alleli mutati. Queste tecniche vengono attualmente applicate mediante 2 analizzatori genetici automatizzati multicapillari ABI PRISM 3100 Avant (Applied Biosystems). Sono inoltre state automatizzate sia le fasi di preparazione dei campioni, mediante l'uso di una stazione robotizzata MicroLab Starlet (Hamilton), che le fasi di analisi del risultato mediante software dedicati programmabili. Da queste ricerche è quindi scaturita una metodologia d'avanguardia di ricerca mutazionale che pochi laboratori in Italia possono vantare.
L'applicazione di questa metodologia ha consentito l'individuazione, nei pazienti FC afferenti al Centro di Riferimento, di un pannello mutazionale completo di 46 diverse mutazioni del CFTR, delle quali 29 aggiuntive rispetto alle 17 che vengono trovate mediante il pannello iniziale; tra quelle aggiuntive, 6 sono state da noi descritte per la prima volta (erano cioè "nuove") e 4 di esse (2 sono ancora in caratterizzazione) sono state inserite nel database internazionale delle mutazioni del CFTR. La stragrande maggioranza dei pazienti FC afferenti al Centro di Riferimento è quindi caratterizzata dal punto di vista genetico con il ritrovamento di (almeno) 2 mutazioni su 2 diversi alleli. Nonostante gli ottimi risultati, come per ogni ricerca che si rispetti, alcuni problemi vengono risolti ma altri subito si presentano. Rimane infatti da chiarire il significato di quel 4% di alleli sui quali non è stata rinvenuta alcuna mutazione nonostante il sequenziamento esteso (ciò avviene in 29 pazienti del Centro). In questo caso probabilmente si tratta di alterazioni molecolari particolari che andranno ricercate con altre tecniche di indagine. Rimane inoltre da risolvere il problema delle forme atipiche, nelle quali il pannello mutazionale adatto ai pazienti FC classici si rivela meno sensibile. Per non parlare dell'assegnazione dell'esatto significato funzionale (a livello biochimico, cellulare e clinico) a ciascuna mutazione trovata e, quindi, del problema del rapporto tra genotipo e fenotipo.
In una seconda fase del progetto ci siamo concentrati proprio su quest'ultimo aspetto. A tale riguardo abbiamo ormai completamente a punto, grazie anche alla disponibilità e ampia collaborazione di alcune famiglie di pazienti, le metodiche di raccolta dei campioni biologici da paziente ("brushing" nasale) e di analisi dell'RNA, la macromolecola che "riceve" l'informazione genetica dal DNA e si occupa quindi del primo passaggio verso la sintesi della proteina che svolge poi la sua funzione a livello cellulare. In alcuni di questi campioni abbiamo già evidenziato anomalie nel processamento dell'RNA che sono probabilmente alla base della patologia nel corrispondente paziente. Anche in questo caso non sono molti i laboratori in Italia che abbiano le competenze e l'organizzazione per effettuare studi funzionali.
Inoltre, poiché una delle fonti di variabilità nella FC è la possibile presenza di più mutazioni contemporaneamente sullo stesso allele (fenomeno noto come "variabilità intragenica da alleli complessi"), nei pazienti con stesse mutazioni ma manifestazioni cliniche molto differenziate, abbiamo ulteriormente esteso la ricerca mutazionale, senza arrestarla al ritrovamento delle prime 2 mutazioni su 2 alleli diversi, ma cercando anche ulteriori mutazioni sullo stesso allele dove già ne è presente una. Anche questo approccio ha dato i risultati sperati. Infatti, finora sono stati identificati 4 diversi alleli complessi, che spiegano la differente gravità delle manifestazioni cliniche riscontrate.
Una parte dei risultati di queste ricerche sono stati pubblicati in 2 articoli su riviste internazionali e presentati a congressi sia nazionali che internazionali mediante 16 comunicazioni.
Tra i problemi ancora aperti c'è quello di una efficiente individuazione dei portatori di mutazione FC nella popolazione generale. Finalmente si inizia a parlare, anche grazie alla nostra attività, dell'attivazione a livello nazionale di un programma pilota di screening genetico del CFTR nella popolazione adulta in età preconcezionale. La nostra metodologia di ricerca mutazionale presenta caratteristiche di economicità e rapidità di esecuzione tali da averci consentito di proporla come metodo da impiegare in questa ricerca. Saremo quindi senz'altro coinvolti anche in questo nuovo e ambizioso progetto verso il quale, ne sono certo, non mancherà l'entusiasmo e l'appoggio dell'Associazione Laziale FC.


Il responsabile dei progetti

Marco Lucarelli
 

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