PROGETTO DI RICERCA VOLTO ALLA COMPLETA CARATTERIZZAZIONE GENETICA DEI PAZIENTI AFFERENTI AL CENTRO DI RIFERIMENTO REGIONALE FIBROSI CISTICA DEL LAZIO

Come il triennio precedente, anche questo anno di progetto è stato sviluppato in collaborazione tra il Centro di Riferimento Regionale per la Fibrosi Cistica del Lazio, Istituto di Clinica Pediatrica, e la Sezione di Biochimica Clinica, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia; entrambe sono strutture dell'Università degli Studi di Roma "La Sapienza". Nell'ultimo anno di progetto l'Associazione Laziale Fibrosi Cistica ha sostenuto con una borsa di studio la Dott.ssa Silvia Pierandrei che ha proseguito le ricerche intraprese nel triennio precedente. In alcuni aspetti particolari del progetto di ricerca (indagini sulle forme atipiche e abbattimento del rischio nelle coppie con un portatore) la Dott.ssa Pierandrei è stata inserita in un gruppo di ricerca più ampio operante nell'ambito della Sez. di Biochimica Clinica. Lo scopo generale di questo anno di progetto è stato quello di mettere in opera una procedura a 3 fasi, ottimizzata nel periodo progettuale precedente, per la ricerca delle mutazioni del CFTR in forme sia tipiche che atipiche di FC e di caratterizzare completamente (mediante il ritrovamento di 2 mutazioni) il maggior numero possibile di pazienti affetti e/o soggetti con sospetto diagnostico afferenti al Centro di Riferimento FC. Ciò è fondamentale, come già descritto nell'introduzione della precedente relazione scientifica triennale (reperibile on-line sul sito dell'Associazione e a cui si rimanda) sia dal punto di vista della ricerca di base, consentendo il miglioramento della definizione del rapporto tra genotipo e fenotipo, sia dal punto di vista della ricerca applicata, migliorando l'aspetto diagnostico, prognostico e terapeutico. Una parte dei risultati conseguiti nel triennio precedente sono stati pubblicati in un lavoro a stampa (allegato alla presente relazione e nel quale l'Associazione compare nei ringraziamenti) sulla rivista internazionale "Analytical Biochemistry" .

LA METODOLOGIA A 3 FASI PER LA RICERCA MUTAZIONALE NEL CFTR

La progettazione, ottimizzazione e validazione, durante le precedenti fasi di ricerca, di un saggio originale di indagine rapida (CF-SNAP+20) ha permesso di mettere in opera e consolidare, durante questo anno di progetto, una procedura a 3 fasi, ottimale per l'Italia Centrale, di individuazione delle mutazioni del CFTR. In particolare la metodologia standard che viene attualmente seguita nell'approccio integrato tra il Centro FC e la Sez. di Biochimica Clinica di ricerca mutazionale in pazienti e sospetti FC, è il seguente.

Fase 1.

Viene applicato il test di I livello CF-OLA (presso il Centro FC) che consiste nella ricerca delle 33 mutazioni più comuni del CFTR, di cui 19 rappresentate nell'Italia Centrale. Sebbene più della metà dei pazienti siano completamente caratterizzati dal punto di vista genetico mediante questo test iniziale, tutti gli altri necessitano di test genetici a più alta sensibilità diagnostica.

Fase 2.

A quei pazienti non completamente caratterizzati durante la fase precedente, viene applicato (presso la Sez. di Biochimica Clinica) il nostro test (CF-SNAP+20) comprendente un pannello specifico di 14 mutazioni regionali (particolarmente frequenti nell'Italia centrale) del gene CFTR (aggiuntive rispetto alle 19 precedenti); qualora esista il sospetto diagnostico di forma atipica di FC, in questa fase viene anche indagato (sempre mediante una tecnica messa a punto dal nostro gruppo di ricerca) il tratto (TG)mTn.

Fase 3.

Ai pazienti ancora non completamente caratterizzati durante la fase precedente, viene applicato (presso la Sez. di Biochimica Clinica) il test di II livello, cioè il nostro metodo di sequenziamento completo delle regioni codificanti, delle zone introniche (non codificanti) adiacenti gli esoni e della zona iniziale, anch'essa non codificante ma di regolazione (5' -flanking) del gene CFTR. Alcuni vantaggi di tale metodologia che si sono resi evidenti nel corso di questo anno di progetto sono:
a) l'uso di una comune piattaforma strumentale semiautomatizzata ABI PRISM per tutte e 3 le fasi, che rende la metodologia rapida;
b) il formato a 96-well, che permette di analizzare molti campioni contemporaneamente;
c) il costo contenuto, ottenuto soprattutto grazie all'approccio progressivo: molti campioni vengono completamente caratterizzati nelle fasi 1 e 2, pochi necessitano della fase 3.
L'utilizzo di questa metodologia a 3 fasi su scala nazionale è stata da noi proposta, mediante una comunicazione orale, nell'ultimo Congresso Italiano Fibrosi Cistica (Firenze, novembre 2006). Questa metodologia è stata applicata, nell'ultimo anno di progetto, a 77 pazienti affetti da forme tipiche di FC, 48 soggetti con forme atipiche di FC o sospetto diagnostico, 27 coppie, comprendenti un portatore di mutazione FC, per l'abbattimento del rischio genetico.

ANALISI MUTAZIONALE DEL CFTR NEI PAZIENTI AFFETTI E NELLE COPPIE A RISCHIO INTERMEDIO MEDIANTE LA METODOLOGIA A 3 FASI

Stato dell'arte sulle caratterizzazioni genetiche dei pazienti affetti da FC in forma tipica.

Nel data base degli affetti FC afferenti al Centro di Riferimento risultano 418 pazienti totali. Solo a 16 di questi pazienti deve ancora essere applicato il test di I livello e solo a 21 quello di II livello. É da tener presente che in realtà, per questi 37 pazienti, la difficoltà maggiore risiede nella fase preanalitica del reclutamento del paziente (trattandosi la maggior parte di pazienti di cui non è prontamente disponibile il DNA) piuttosto che nella fase analitica di ricerca delle mutazioni. A tutti gli altri pazienti (a meno di altri 35 persi al follow-up) è stata applicata la nostra metodologia. Al momento risultano quindi 346 pazienti analizzati, di cui 321 completamente caratterizzati dal punto di vista genetico. Nonostante l'applicazione del sequenziamento completo, 17 pazienti risultano con una mutazione non trovata e 4 con entrambe le mutazioni non trovate. É probabile che in questi pazienti possano essere presenti delezioni o mutazioni pienamente introniche che non sono indagate mediante le tecniche utilizzate. In questo caso è opportuno che si proceda alla ricerca specifica delle delezioni più comuni.
É stata inoltre condotta la ricerca mutazionale mediante questa metodologia in 2 famiglie particolarmente complesse dal punto di vista genetico e con gravidanza in corso, per le quali la completa caratterizzazione genetica ha consentito una adeguata consulenza genetica e l'offerta di una eventuale indagine prenatale dal significato certo.

Mutazioni individuate e sensibilità diagnostica.

Nei pazienti con forme tipiche di FC afferenti al Centro, sono state individuate in totale 47 differenti mutazioni del CFTR, di cui 19 inserite nel pannello di I livello (CF-OLA), 14 in quello regionale specifico (CF-SNAP+20) e altre 14 trovate mediante il metodo di II livello. La sensibilità allelica cumulativa risulta:
Fase 1, I livello CF-OLA = 77,6%
Fase 2, pannello specifico regionale CF-SNAP+20 = 87,8% (+10,2%)
Fase 3, II livello sequenziamento completo = 96.4% (+8,6%).
In pratica ciò significa che se analizzassimo 50 pazienti affetti da forma tipica di FC, cioè 100 alleli CFTR mutati, alla fase 1 ne sfuggirebbero circa 22, alla fase 2 ne sfuggirebbero circa 12 e alla fase 3 ne sfuggirebbero solo 4. Risulta evidente l'utilità diagnostica di questo approccio per le future nuove diagnosi.
Per la maggior parte dei pazienti risultati con 2 mutazioni è stata analizzata la segregazione allelica nei genitori (per accertare che le 2 mutazioni rinvenute si trovino su 2 alleli diversi e siano in effetti causa di malattia). Per alcuni pazienti l'analisi segregazionale è ancora in corso.

Abbattimento del rischio genetico.

É risultato particolarmente utile applicare la fase 2 anche a quei soggetti, negativi alla ricerca mutazionale condotta nella fase 1, ma partner di portatori di mutazione FC. In queste coppie (dette a rischio intermedio) esiste un rischio legato alla possibile presenza, nel partner negativo alla fase 1, di una mutazione non compresa nel pannello indagato. Tanto meno probabile è la presenza di tale ipotetica mutazione, tanto minore sarà il rischio. Dovrebbe risultare evidente che una maggiore sensibilità diagnostica (in pratica un maggior numero di mutazioni indagate) produrrà un abbattimento del rischio. Sarebbe utile, in queste coppie, arrivare alla fase 3 (massimo abbattimento del rischio); ciò è tuttavia improponibile per tempi e costi legati ai metodi di II livello. Invece, l'applicazione della fase 2 è risultata pienamente sostenibile e utile, con un dimezzamento del rischio rispetto all'applicazione della sola fase 1. In pratica, se ad una coppia formata da un portatore e dal partner negativo al test di I livello non applicassimo ulteriori test genetici il rischio di concepimento di un figlio malato di FC sarebbe di 1 su 468 (0,21%); applicando invece la fase 2 al partner negativo al test di I livello, il rischio di concepire un figlio affetto da FC, qualora anche la fase 2 risultasse negativa, sarebbe di 1 su 872 (0,11%). L'applicazione della nostra metodologia fino alla fase 2 in queste coppie consente quindi una notevole riduzione del rischio residuo e una più agevole consulenza genetica.

ANALISI MUTAZIONALE DEL CFTR NEI SOGGETTI CON FORME ATIPICHE O DIAGNOSI INCERTA

Nel corso del progetto è diventato di sempre maggior rilevanza il problema della diagnosi nelle forme atipiche di FC. Molti di questi soggetti presentano infatti una diagnosi incerta, il che pone anche problemi terapeutici e prognostici. In continuità con il precedente progetto, nel corso dell'ultimo anno la metodologia a 3 fasi è stata applicata anche a numerosi soggetti con forme atipiche di FC (ad esempio soggetti con infertilità maschile, neonati con ipertripsinemia alla nascita, soggetti oligosintomatici) per ricercare mutazioni e/o tratti varianti specifici che possano in qualche modo costituire la base molecolare della loro eventuale patologia.
Questo approccio consente anche di trovare nuove variazioni di sequenza del DNA. Quando ciò avviene, occorre dimostrare che tale variazione sia una mutazione causa di malattia e non semplicemente un polimorfismo (normale variabilità interindividuale). In genere si procede cercando di dimostrare che:
1) la frequenza della variazione di sequenza trovata è estremamente bassa in una popolazione di non affetti (o anche assente);
2) il cambiamento di sequenza provoca un cambiamento di aminoacido in una regione critica della proteina;
3) nel soggetto affetto in cui è stata trovata la variazione di sequenza non siano presenti altre mutazioni sullo stesso allele (ma è presente un'altra mutazione sull'altro allele).
Per alcune mutazioni (ad esempio quelle di splicing) sono praticabili, in maniera relativamente semplice, anche studi funzionali a livello di RNA messaggero. Ci siamo concentrati soprattutto su variazioni introniche o esoniche silenti (senza cambio aminoacidico), che possono causare forme atipiche di FC producendo un alterato processamento dell'RNA; questa scelta si deve sopratutto al fatto che RNA anomali possono essere evidenziati più facilmente, rispetto alle alterazioni di funzionamento a livello proteico, mediante tecniche specifiche. Ciò non esclude l'interesse di eventuali studi relativi a sostituzioni aminoacidiche che possano alterare il funzionamento della proteina cftr.
Numerose variazioni di sequenza dall'incerto significato funzionale sono state rilevate anche in questo ultimo anno di progetto. Nel complesso (comprendendo anche quelle evidenziate nelle precedenti fasi progettuali) abbiamo evidenziato 48 variazioni di sequenza (di cui 13 nell'ambito di questo anno) tra cui alcune mai precedentemente descritte, potenzialmente coinvolte nella definizione di queste forme atipiche. Per molte di queste variazioni è stato effettuato il confronto della loro frequenza tra la popolazione generale e le popolazioni sospette. Per una delle variazioni la cui frequenza è risultata significativamente più elevata nelle popolazioni sospette che nella popolazione generale, è stata effettuata la caratterizzazione funzionale mediante studi di espressione del CFTR, evidenziando un possibile splicing anomalo.