Completamento seq. CFTR - Dott.ssa Stamato Stampa

Relazione finale Dott.ssa Stamato

I cinque mesi di ricerca finanziati dall'Associazione Laziale Fibrosi Cistica hanno permesso di completare il sequenziamento del gene CFTR in un campione di 32 neonati selezionati alla nascita dal programma di Screening. Tutti i soggetti esaminati risultavano positivi al primo dosaggio della tripsina immunoreattiva (IRT) e il 48% di essi presenta ipertripsinemia persistente. Inoltre, circa un terzo dei soggetti positivi allo screening mostrava valori del test del sudore border-line e valori della chimotripsina normali (tranne quattro: due patologici e due border-line). Tutti i soggetti in esame, tranne uno, risultavano portatori di una mutazione del gene CFTR al pannello standard di screening che esamina trentuno mutazioni. L'analisi genetica estesa condotta sui 32 soggetti ha permesso di stabilire che circa il 44% dei pazienti analizzati mostra un genotipo eterozigote composto compatibile con forme mild di FC, mentre la percentuale sale a circa il 62% se consideriamo affetti anche i soggetti con tratto variante TG12 e/o T5. Tali risultatati hanno indotto il Centro a modificare il sistema di valutazione dei neonati selezionati da screening. Infatti ora tutti i neonati con ipertripsinemia, eterozigoti al pannello standard di screening e con test del sudore > 25mmol/L vengono sottoposti ad un ulteriore test genetico ed a controlli clinici periodici. L'indagine genetica è stata effettuata anche su altri due neonati che hanno raggiunto il Centro per sintomi. Tali neonati, sfuggiti al programma di screening, hanno mostrato valori del test del sudore prossimi al patologico, un genotipo eterozigote al pannello delle trentuno mutazioni effettuato presso il Centro e da sequenziamento, in entrambi, è stato riscontrato l'allele variante TG12/T5. Su questi ultimi due soggetti il sequenziamento è tuttora in fase di completamento poiché inseriti nel progetto di ricerca in un momento successivo rispetto al gruppo dei trentadue. Se dopo sequenziamento completo del gene CFTR, per tali due soggetti il genotipo dovesse rimanere eterozigote composto con l'allele variante TG12/T5, potremmo avvalorare l'ipotesi che tale allele variante può essere considerato causa di malattia. Dai risultati ottenuti emerge che lo screening neonatale positivo, oltre ad individuare le forme classiche di FC, seleziona anche le forme lievi ( definite anche atipiche ). Le forme atipiche di FC sono difficilmente diagnosticabili soprattutto nei neonati perché con scarsa o addirittura assente sintomatologia. Tuttavia, l'approfondita indagine genetica, consentendo la caratterizzazione dei soggetti che potrebbero sviluppare negli anni situazioni riconducibili a FC, consente di sottoporre gli stessi ad un piano di cure adeguato fin dalla nascita e di seguire il loro follow up presso il Centro. In tale periodo ho individuato una nuova variazione di sequenza nell'esone 13 del gene CFTR in un neonato ipertripsinemico selezionato alla nascita dal protocollo di screening, eterozigote all'analisi di I livello (PCR-OLA-SCS) e con test del sudore border-line. Tale soggetto faceva parte di un progetto di ricerca eseguito presso il Centro Fc. Ho preso parte a questo progetto sia durante il periodo di internato effettuato nel Centro FC, sia successivamente grazie ad una borsa di collaborazione erogata dall'Associazione stessa nel periodo marzo-luglio 2005. I risultati ottenuti con questo lavoro sono stati sottoposti ed accettati, sia come poster che come comunicazione orale (da me sostenuta), al I congresso SIFC, tenutosi a Roma nei giorni 1-3 dicembre 2005. La variazione di sequenza del soggetto di cui sopra, mai descritta in precedenza, è stata individuata con sequenziamento diretto del gene CFTR e confermata successivamente con un secondo prelievo venoso. È in corso il sequenziamento totale del gene CFTR per verificare che nessun'altra mutazione sia presente oltre le due già descritte. Inoltre, nello stesso periodo mi sono occupata della caratterizzazione genetica di un soggetto adulto in cura presso il Centro. All'analisi di I livello il soggetto risultava omozigote per la mutazione DF508, risultato assolutamente compatibile con il suo quadro clinico. Quando, per verifica dell'effettiva omozigosi, sono stati sottoposti ad analisi di I livello i genitori del soggetto, si è riscontrata la mutazione DF508 solo nel padre. È stato necessario, dunque, sequenziare direttamente l'esone 10 del gene CFTR dei tre soggetti per chiarire l'effettiva natura dell'omozigosi avuta all'analisi di I livello. Con il sequenziamento diretto è risultato chiaro che il soggetto in esame ha la DF508 in eterozigosi e presenta, sempre nell'esone 10, poche basi a monte della tripletta deleta per la DF508, una mutazione mai precedentemante descritta in letteratura. La nuova mutazione è stata riscontrata nella madre del soggetto in esame mentre nel padre il sequenziamento ha confermato la DF508 in eterozigosi.
Attualmente è in corso la conferma della nuova mutazione su un secondo prelievo dell'affetto e la verifica, mediante sequenziamento totale del gene, che nessun'altra mutazione sia presente oltre le due già descritte. Risulta evidente quanto sia importante verificare la segregazione allelica, soprattutto nelle presunte omozigosi, poiché il falso risultato di omozigosi all'analisi di I livello può essere dovuto all'interferenza di una nuova mutazione con la zona di attacco dei primers dell'OLA.
Se, al termine del sequenziamento totale del gene CFTR dei due soggetti in esame, le due variazioni di sequenza risulteranno realmente delle mutazioni, il risultato sarà pubblicato sul sito Cystic fibrosis mutation database (www.genet.sickkds.on.ca/cftr/).
Con la presente relazione vorrei porgere i mie ringraziamenti più sentiti all'Associazione Laziale Fibrosi Cistica poiché mi ha consentito, con il finanziamento di cui sono stata titolare, di portare a termine un progetto di ricerca da me seguito durante i due anni di internato svolto nel laboratorio di biochimica e biologia molecolare (Responsabile Dott.ssa Narzi) del Centro di Riferimento Regionale FC ( Responsabile Dott.ssa Quattrucci). Inoltre, durante i cinque mesi finanziati dall'Associazione ho continuato anche a partecipare attivamente all'attività assistenziale del Centro eseguendo i test del sudore.

 

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